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超順磁性氧化鐵納米粒子標記心臟內骨髓間充質干細胞及活體磁共振

添加日期：2010年5月6日 閱讀：2068

　　急性心肌梗死是冠心病中*危險的疾病類型，目前通過干細胞移植促進心肌細胞再生和血管新生，成為心血管疾病治療的一大熱點。干細胞在體內遷移、增殖和分化等生物學變化是影響療效的重要因素，但目前對體內干細胞定量、定位及追蹤其轉歸還比較困難。本實驗通過MRI檢查對移植入體內超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamaganeticironoxidenanoparticles，SPIO）標記的骨髓間充質干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）進行活體示蹤，探討該方法能否作為一種無創(chuàng)的手段來示蹤心臟內干細胞的遷移和轉歸。
　　
　　１材料與方法
　　
　�。保敝饕噭┖驮O備２周齡雄性SD大鼠（８０～１００g，上海動物實驗中心），L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（GIBCO公司），F(xiàn)ITC-CD９０、FITC-CD４５（Serotec公司），SPIO（上海交通大學納米技術研究院），cm-DiI（invitrogen公司），倒置光學顯微鏡（Leica公司），流式細胞儀（Beckman公司），酶標儀（ZD-Ⅱ型，Labsystem公司），動物呼吸機（上海嘉鵬科技公司），磁共振３．０T（美國GE公司）。
　　
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　�。保玻盡SCs的分離、培養(yǎng)大鼠頸椎脫臼處死，取股骨、脛骨，用L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔收集骨髓細胞，１５００r／min離心５min，細胞沉淀加入含１０％胎牛血清（含青霉素１００U／L、鏈霉素１００mg／L）的L-DMEM吹打成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，３７℃、５％CO２培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用貼壁篩選法，２４h**換液，以后每３d更換培養(yǎng)液，當８０％～９０％細胞鋪滿瓶底時，胰酶消化細胞后１∶２傳代。
　　
　�。保玻布毎麡擞浫〉冢荡≒５）MSCs，SPIO（７５μg／mL）標記２４h后普魯士藍染色觀察標記率。
　　
　�。保玻矼TT法測定SPIO對標記細胞活性的影響SPIO標記的MSCs培養(yǎng)至２d，胰酶消化后接種至９６孔培養(yǎng)板，對照組為未標記細胞，每組各１０孔。每孔加MTT溶液（５mg／mL），４h后加DMSO１５０μL／孔，酶標儀（波長５７０nm）測OD值。SPIO標記培養(yǎng)至１５d再作MTT。
　　
　�。保玻唇⒓毙孕募」Ｋ来笫竽Ｐ痛笫舐樽砗笮袣夤懿骞堋Ｐ毓桥宰髠茸隹v切口，鈍性分離各層肌肉，開啟呼吸機（呼吸頻率５０次／min，潮氣量４０mL），剪斷第４肋骨，暴露心臟，結扎左前降支。
　　
　�。保玻导毎浦布胺纸M實驗動物為磁性細胞移植組、納米粒子移植組和非磁性細胞移植組，每組８只；分別在心肌梗死邊緣區(qū)注射SPIO標記的MSCs、SPIO溶液（鐵濃度５０μg／mL）、未標記的MSCs，每只動物４個注射點，共１００μL（３×１０６細胞）。
　　
　�。保玻禡R顯像術后３、７、１４、２１d行MRI檢查。采用心電門控技術，T１顯像采用SE序列，掃描時間２min３９s，TE１０ms，TR５００ms，帶寬３１．２５，層厚１．５mm，層間距０．０mm，矩陣２５６×１２８，視野１２cm×１２cm，NEX２．０；T２顯像采用FRFSE序列，掃描時間７min１５s，TR１５００ms，TE３１ms，層厚１．５mm，層間距０．０mm，矩陣１２８×１２８，NEX２４．００，帶寬２０．８３，視野１２cm×１０cm，回波鏈長度９，從心尖至心底一共掃描９～１０層。
　　
　�。保玻方M織學檢查術后３周處死動物，取左心室，固定、脫水、透明、石蠟包埋。冠狀切片作HE染色、普魯士藍染色。
　　
　　１．３統(tǒng)計學分析SAS８．０統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較用方差分析、t檢驗。P＜０．０５為差異有統(tǒng)計學意義。
　　
　　2結果
　　
　�。玻奔毎麡擞浡孰S機計數(shù)１０個視野，SPIO標記的MSCs經普魯士藍染色后胞漿內可見藍色鐵顆粒，標記陽性率達９５％（圖１）。
　　
　�。玻睸PIO對MSCs活性的影響MTT法測定SPIO標記MSCs后２、１５d與未標記的MSCs（對照組）的OD值比較差異無統(tǒng)計學意義（２dP＝０．０９６，１５dP＝０．３５７）。
　　
　�。玻矼RI顯像結果（１）大鼠梗死部位心�。òüＫ肋吘墔^(qū)）T１像信號降低，但不明顯；T２像信號明顯增強。SPIO標記的MSCs在T２像呈低信號（灰色或黑色）（圖２A），與周圍梗死心肌高信號比較而能識別，在T１像不能辨認。（２）磁性細胞移植組術后３、７、１４d能在MRIT２像清楚顯示的注射點分別為６５．６％、５６．３％、１８．８％（表現(xiàn)為T２像低信號區(qū)），顯影動物數(shù)分別為８、８、５只。至術后第３周不能顯示低信號的注射點。隨時間的**，低信號區(qū)域由邊界清楚向邊緣模糊改變，低信號區(qū)域范圍有擴大趨勢至*后的消失，信號對比度也隨之降低（圖２A～D）。在T１像無法辨認磁性細胞移植組的移植細胞，且非磁性細胞移植組、納米粒子移植組在第３、７、１４、２１天均未能在T１、T２像檢測到所移植的細胞或納米粒子。
　　
　�。玻唇M織學檢查磁性細胞移植組組織切片經普魯士藍染色后鏡下可見梗死區(qū)（圖３A）有胞漿含有藍色鐵顆粒的移植細胞，而納米粒子移植組未見藍色鐵顆粒的納米粒子（圖３B）。
　　
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　　干細胞移植后在受體中觀察其遷移和轉歸一直是讓人困擾的問題。其中MRI成像時間較長，可觀察細胞的動態(tài)遷徙過程，空間、時間分辨率高，對比度好，可以活體示蹤移植細胞，因而被廣泛應用。SPIO是一種新型的MRI對比劑，能顯著增強T２弛豫效能，在磁共振T２像呈低信號（灰色或黑色），因而能被檢測到［１］。SPIO磁敏感性較高，對細胞**性，基本不影響干細胞的活性及增殖和分化能力［２－４］，并且被細胞代謝后能進入正常血漿鐵池，與紅細胞血紅蛋白結合［５］，并在調理素作用下被網狀內皮系統(tǒng)識別、吞噬細胞攝取。本實驗中SPIO平均直徑３０～４０nm，表面包被葡聚糖，以７５μg／mL鐵濃度孵育能有效標記MSCs達９５％。MTT法結果發(fā)現(xiàn)SPIO標記后第２、１５天MSCs活性正常，與以往研究結果相同。
　　
　　本研究發(fā)現(xiàn)磁性細胞移植組術后３、７、１４d在MRIT２像清楚顯示的注射點分別為６５．６％、５６．３％、１８．８％，至術后３周不能顯示低信號注射點。隨時間的**，低信號區(qū)域由邊界清楚向邊緣模糊改變，低信號區(qū)域范圍有擴大趨勢至*后的消失，信號對比度也隨之降低。這說明超順磁性Fe３O４納米粒子可以作為示蹤劑在磁共振下對移植入心肌梗死周邊區(qū)的MSCs進行早期體內示蹤。
　　但本研究中移植后３d有約３５％的注射點未能顯影，這可能與這些注射點細胞數(shù)較少有關。１周后低信號區(qū)域對比度下降可能由于MSCs分裂及遷移所致，使單位像素內的鐵濃度下降［６］。Kraitchman等［６］認為干細胞死亡后被巨噬細胞清除也導致對比度下降。
　　
　　但本研究發(fā)現(xiàn)MSCs死亡后釋放的SPIO可能更多地進入血液循環(huán)被代謝掉，而不是被其他細胞（如巨噬細胞）所吞噬。因為本研究中發(fā)現(xiàn)納米粒子移植組的心肌組織經普魯士藍染色未見藍色鐵粒子，說明SPIO直接注射入心肌后大部分進入了血液循環(huán)而不是被巨噬細胞或其他細胞所吞噬。
　　
　　本實驗證實SPIO可以作為示蹤劑在磁共振下對移植入梗死邊緣區(qū)的MSCs進行體內追蹤，該方法可作為一種無創(chuàng)的手段來示蹤體內干細胞的遷移及轉歸。但實驗對象為小動物，有所不足，日后可以對大動物進行更深入的研究。

責任編輯：小徐 pndqq.cn 2010-5-6 9:21:51

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